Инфекционная бурсальная болезнь (ИББ) является одной из наиболее важных вирусных болезней молодняка промышленных птиц. В структуре вируса инфекционной бурсальной болезни есть четыре основных белка: VP1, VP2, VP3, VP4. Белки VP2 и VP3 содержат основные антигенные области, ответственные за индукцию вируснейтрализующих антител, защищающих птицу от вируса ИББ.
Данные белки используются не только для создания вакцин против данной болезни, но и для разработки серологических диагоностикумов (иммуноферментного анализа, реакции диффузионной преципитации и т. д.). На базе ФГБОУ ВО СПбГУВМ и ФГБОУ ВО СПбГУ получены штаммы Escherichia coli, которые синтезируют полноразмерный белок VP2. Данный белок используется для разработки набора для иммуноферментного определения антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни.
В качестве источника гена оболочечного гликопротеина VP2 использовали эпизоотический штамм инфекционной бурсальной болезни «Синявинский», полученный в компании ООО «Кронвет». Кодирующая последовательность VP2 в предыдущих работах была встроена в состав плазмиды pPICZa-VP2- His-out.
В данной работе эта последовательность была амплифицирована с использованием набора Thersus PCR kit («Евроген», Россия). Далее она была встроена в состав плазмиды рET23а с использованием сайтов Ndel и Xhol, добавленных в составе прайме- ров. Для выделения фрагментов ДНК из агарозно-го геля и реакционных смесей использовали набор Cleanuр Standard («Евроген», Россия). Также при получении плазмиды рET23-VP2 использовали ре- стриктазы Ndel и Xhol («Сибэнзим», Россия), лигазу T4 («Евроген», Россия) и штамм бактерий Escherichia coli DH5a. Плазмидную ДНК из бактериальных клеток выделяли с помощью набора Plasmid Miniprep («Евроген», Россия). Плазмиду рET23-VP2 проверяли с помощью секвенирования и использовали для трансформации штамма BL21 (DE3) («Евроген», Россия). Для наработки белка полученный штамм-продуцент культивировали в среде LB с добавлением индуктора ИПТГ. При выделении белка клетки бактерий собирали центрифугированием, разводили в буфере PBS и разрушали с помощью обработки ультразвуком. После центрифугирования отбирали супернатант, содержавший растворимые белки. Выделение белка VP2 для проведения ИФА проводили за счет добавленной к нему гистидиновой метки с использованием набора His-Spin Protein Miniprep (ZymoResearch, США).

Сенсибилизацию планшетов проводили путем внесения в каждую лунку планшета по 7 мкг раствора очищенного белка VP2 в 100 мкл бикарбонатного буфера. Планшет инкубировали в течение 16 часов при температуре +4 °C. После удаления несвязавшихся компонентов в лунки вносили по 200 мкл 5% раствора БСА в PBS. Планшет инкубировали в течение 3 часов и проводили иммуно- ферментный анализ с использованием компонентов набора ID Screen IBD VP2 производства ID vet (Франция).
Для проведения иммуноферментного анализа использовали четыре сыворотки крови птиц. Две сыворотки с высокими титрами антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни, полученные после вакцинации птиц на базе ФГБОУ ВО СПбГУВМ и две сыворотки свободные от антител, проверенные на наборе ID Screen IBD VP2. Результаты анализа учитывали на спектрофотометре Multiskan FC. В результате проведенного анализа оптическая плотность положительных сывороток была 0,7 и 0,9 при длине волны 450 нм, а показатель отрицательных сывороток был менее 0,1. Эти данные показывают, что белок VP2 успешно сорбирован на полистироловом планшете, и антитела в сыворотке птиц на вирус инфекционной бурсальной болезни распознают его. Также стоит отметить низкую оптическую плотность отрицательных образцов, чтоговорит о чистоте выделенного рекомбинантного белка за гистидиновую метку.
Таким образом, можно сделать вывод, что рекомбинантный белок VP2 вируса инфекционной бурсальной болезни можно использовать в качестве антигена для разработки серологической тест-системы (иммуноферментного анализа) на определение антител в сыворотке крови птиц. Стоит отметить, что в Российской Федерации отсутствуют отечественные наборы на определение данного белка, хотя множество птицефабрик применяют рекомбинантные вакцины против инфекционной бурсальной болезни (Vaxxitek HVT + IBD, INNOVAX- ND-IBD и т. д.), поэтому разработка данного набора является актуальным направлением исследований на сегодняшний день.